如何使用MTT比色法判断T细胞密度？

MTT比色法是一种通过检测细胞代谢活性来间接反映细胞密度（即活细胞数量）的常用方法?。其核心原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲臜（Formazan）结晶，而死细胞无此功能?。随后，用DMSO等溶剂溶解甲臜结晶，通过测定其吸光度（OD值）即可间接反映活细胞的数量?。
实验步骤与密度判断
以下是使用MTT法判断T细胞密度的关键步骤和要点：
?细胞准备与接种?：首先将T细胞培养至对数生长期，消化后调整细胞浓度，并接种到96孔板中?。?接种密度?是判断的基础，通常每孔接种1000-10000个细胞，具体数量需根据T细胞的生长速度和实验目的优化?。例如，对于生长较慢的T细胞，可能每孔接种2000-3000个细胞?。

?孵育与处理?：接种后，根据实验设计加入处理剂（如药物、刺激物等），在CO?培养箱中孵育一定时间（通常24-48小时）?。孵育后，细胞密度会因增殖或抑制而变化。

?MTT染色与检测?：吸去培养上清，每孔加入含MTT的培养基，孵育4小时?。活细胞会将MTT还原为甲臜结晶。随后，加入DMSO溶解结晶，在酶标仪上测定OD值。

?结果分析与密度判断?：MTT实验测得的是?相对细胞数和相对活力?，而非绝对细胞数。?OD值范围?是判断密度的关键指标：

?空白对照组?（无细胞，仅培养基和MTT）：OD值通常在0.1-0.3之间?。
?阴性对照组?（有细胞，无处理）：OD值一般在0.3-0.8范围内?。
?实验组?：若OD值超过1.5，提示细胞活性较高；若低于0.5，可能表明细胞受到明显抑制?。通过比较实验组与对照组的OD值，可以计算细胞存活率或增殖率，从而间接反映细胞密度的变化?。
注意事项
?细胞密度优化?：接种密度过高可能导致细胞受限和死亡，过低则结果不可靠，需根据T细胞类型预先优化?。
?MTT浓度与时间?：MTT浓度和作用时间需根据细胞类型优化，通常孵育1-4小时?。
?设置对照?：必须设置正常对照组（未处理细胞）和空白对照组（无细胞），以消除背景干扰?。
?OD值范围?：MTT的OD值正常范围在0.1-3.0之间，具体数值与细胞活性和实验条件相关?。