大鼠原代角膜成纤维细胞的操作注意事项

大鼠原代角膜成纤维细胞的操作需严格遵循无菌原则、培养条件控制及质量保障规范，以确保细胞活性与实验可靠性。

?一、样本处理阶段?
?取材与消毒?

取材后立即用含双抗（青霉素+链霉素）的PBS冲洗5次以上，去除血污及杂质?。
角膜组织需在体视显微镜下精细修剪，避免残留结缔组织或上皮细胞污染?。
?组织消化?

推荐使用IV型胶原酶（37℃震荡消化60分钟）而非胰酶，减少对角膜基质细胞的损伤?。
消化后需用巴氏吸管轻柔吹打，避免过度机械剪切导致细胞碎片增多?。
?二、细胞培养阶段?
?接种与贴壁?

培养皿需预包被鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）或多聚赖氨酸（0.1mg/mL），增强细胞贴壁性?。
接种密度建议为2×10? cells/mL，避免过高密度导致营养竞争?。
?培养基选择?

使用含10%-20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，血清批次需提前验证稳定性?。
每2-3天换液，首次换液在接种后3天进行，避免过早干扰细胞贴壁?。
?三、传代与冻存?
?传代时机?

细胞融合度达80%时需传代，超过90%易导致接触抑制和老化?。
消化时间控制在1-3分钟（0.25%胰酶），显微镜下观察细胞变圆后立即终止?。
?冻存保护?

冻存液需含10% DMSO+90%胎牛血清，程序降温（-1℃/min）至-80℃后转液氮?。
?四、污染与质量控制?
?无菌操作?

超净台紫外照射30分钟后操作，所有器械需酒精灯灼烧灭菌?。
定期检测支原体（建议每2代检测一次）?。
?细胞鉴定?

通过α-SMA免疫荧光染色或胶原合成功能实验验证细胞纯度?。
?五、常见问题处理?
?贴壁不良?：检查包被条件或血清批次，必要时更换培养基?。

?污染?：立即丢弃污染样本，彻底消毒培养箱及操作台?。

?六、注意事项?
原代细胞传代不超过5代，3代内状态最佳?。
避免反复冻融，冻存后细胞活性需通过台盼蓝染色验证（存活率＞90%）?。
培养操作注意事项
七、无菌操作要求
使用大鼠角膜成纤维细胞完全培养基时，需全程保持无菌环境，操作前对超净台、培养瓶及工具进行消毒，避免污染影响细胞状态。
培养基与环境控制
培养基不宜长时间暴露于室温或高温环境，冻融后若出现少量絮状物，不影响使用，但需确保在保质期内使用，过期产品必须废弃。细胞培养需维持37°C、5%CO?的恒温恒湿环境，新鲜细胞收到后应立即放入培养箱静置2-3小时稳定状态。
细胞复苏与传代流程
冻存细胞复苏时，需37°C水浴快速解冻，解冻后加入5ml培养基重悬，1000rpm离心5分钟，弃上清后转入新培养瓶培养；传代时待细胞融合至80%，用PBS清洗后，以0.05%胰酶-EDTA消化，镜下观察细胞变圆后加入终止液终止，离心后分瓶。