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大鼠原代食管上皮细胞实验操作步骤
发表时间：2025-07-08
大鼠原代食管上皮细胞实验操作步骤
在完成大鼠原代食管上皮细胞的分离与培养后，接下来的实验步骤需进一步优化细胞状态，并开展相关功能研究。以下是后续关键操作流程：
1. 细胞换液与观察
接种24小时后，在超净工作台中轻柔吸弃旧培养基，避免扰动贴壁细胞。加入预热的完全培养基（含10%胎牛血清及1%双抗），置于37℃、5% CO?培养箱继续培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态，健康的原代细胞应呈铺路石样紧密排列，若出现悬浮颗粒或大量脱落，需排查污染或消化过度问题。
2. 首次传代处理
当细胞融合度达80%-90%时进行传代。弃去培养基，用PBS轻柔冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化30秒至1分钟。镜下见细胞间隙增大后立即加入含血清培养基终止消化，吹打成单细胞悬液，按1:2比例接种至新培养瓶。原代细胞对酶敏感，需严格控制消化时间。
3. 功能实验准备
传代后的细胞需稳定24小时再进行后续实验。若进行划痕实验或Transwell迁移 assay，需提前将细胞接种于6孔板或小室中，待融合至60%-70%时操作。对于屏障功能研究，可选用Transwell体系培养至形成紧密连接，通过测量跨膜电阻（TEER）评估完整性。
4. 冻存与质量控制
选取状态良好的P2代细胞进行冻存。细胞悬液与冻存液（90%血清+10% DMSO）按1:1混合，分装至冻存管，程序降温后转入液氮。复苏后需检测细胞活性（台盼蓝染色＞85%）及角蛋白19免疫荧光鉴定上皮源性。
?注意事项
- 原代细胞寿命有限，建议在P3代内完成关键实验；
- 所有操作避免反复开盖，以防pH波动影响细胞状态；
- 功能实验需设3次以上生物学重复以确保数据可靠性。
在完成大鼠原代食管上皮细胞的分离与培养后，接下来的实验步骤需进一步优化细胞状态，并开展相关功能研究。以下是后续关键操作流程：
1. 细胞换液与观察
接种24小时后，在超净工作台中轻柔吸弃旧培养基，避免扰动贴壁细胞。加入预热的完全培养基（含10%胎牛血清及1%双抗），置于37℃、5% CO?培养箱继续培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态，健康的原代细胞应呈铺路石样紧密排列，若出现悬浮颗粒或大量脱落，需排查污染或消化过度问题。
2. 首次传代处理
当细胞融合度达80%-90%时进行传代。弃去培养基，用PBS轻柔冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化30秒至1分钟。镜下见细胞间隙增大后立即加入含血清培养基终止消化，吹打成单细胞悬液，按1:2比例接种至新培养瓶。原代细胞对酶敏感，需严格控制消化时间。
3. 功能实验准备
传代后的细胞需稳定24小时再进行后续实验。若进行划痕实验或Transwell迁移 assay，需提前将细胞接种于6孔板或小室中，待融合至60%-70%时操作。对于屏障功能研究，可选用Transwell体系培养至形成紧密连接，通过测量跨膜电阻（TEER）评估完整性。
4. 冻存与质量控制
选取状态良好的P2代细胞进行冻存。细胞悬液与冻存液（90%血清+10% DMSO）按1:1混合，分装至冻存管，程序降温后转入液氮。复苏后需检测细胞活性（台盼蓝染色＞85%）及角蛋白19免疫荧光鉴定上皮源性。
?注意事项
- 原代细胞寿命有限，建议在P3代内完成关键实验；
- 所有操作避免反复开盖，以防pH波动影响细胞状态；
- 功能实验需设3次以上生物学重复以确保数据可靠性。
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